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          離心技術的基礎理論
          2015-06-29 11:26:23|點擊次數:



          1.離心技術的基礎理論

          (1)離心式冷水機組工作原理

          離心是利用旋轉運動的離心力以及物質的沉降系數或浮力密度的差異進行分離、濃縮和提純生物樣品的一種方法。懸浮液在高速旋轉下,由于巨大的離心力作用,使懸浮的微小顆粒(細胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降,從而使溶液得以分離,顆粒的沉降速度取決于離心機的轉速、顆粒的質量、大小和密度。

          當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時,由于重力場的作用可使得懸浮的顆粒逐漸下沉,顆粒越重,下沉越快。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態、密度、重力場的強度及液體的黏度有關。如紅細胞顆粒,直徑為數微米,可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。此外,物質在介質中沉降時還伴隨有擴散現象(擴散是由于微粒的熱運動而產生的質量遷移現象,主要是由于密度差引起的)。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質等,它們在溶液中成膠體或半膠體狀態,僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的,因為顆粒越小沉降越慢,而擴散現象則越嚴重。擴散現象是不利于樣品分離的,如果加大重力,就可能克服擴散現象的不利影響,實現生物大分子的分離。離心機就是利用離心機轉子高速旋轉產生的強大的離心力,迫使液體中微??朔U散加快沉降速度,把樣品中具有不同沉降系數和浮力密度的物質分離開。

          (2)離心力與相對離心力

          離心力:當物體所受外力小于運動所需要的向心力時,物體將向遠離圓心的方向運動。物體遠離圓心運動的現象稱為離心現象也叫離心運動。離心運動是由于向心力消失或不足而造成的。

          相對離心力:是指在離心場中,作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數,單位是重力加速度"g"。

          (3)液體中的微粒在重力場中的分離

          重力沉降:液體中的微粒受重力的作用,較重的微粒下沉與液體分開,這個現象稱為重力沉降。

          沉降速度:指在強大離心力作用下,單位時間內物質運動的距離。

          沉降時間:在實際工作中,常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質從溶液中全部沉降分離出來需用多大轉速與多長時間可達到目的的問題。如果轉速已知,則需確定分離某粒子所需的時間即沉降時間。

          (4)液體中的微粒在重力場中的沉降

          ①當離心機開動時,離心管繞離心轉頭的軸旋轉,作圓周運動(見圖3-1),在離心管內的樣品顆粒將同樣運動;②假如顆粒是處于真空中(即沒有介質阻力時),顆粒會沿切線方向飛去,也就是當離心管由0位轉到1位時,顆粒到達離心管底部A位。對于離心管而言,樣品顆粒由頂位移到了A位,也就是由離心管頂部移到了底部,這與重力場中的由高處落到低處相似。這種顆粒在圓周運動時的切線運動稱為離心沉降;③顆粒作切線運動時將由于介質的摩擦阻力,使其在離心管中依圖3-1中虛線所示的曲線運動,當離心管由0位轉到2位時,顆粒由頂位移到B位。介質的阻力越大,顆粒在離心管中沉降速度越小,沉降的距離也越短。旋轉速度越大,顆粒在離心管中沉降越快。

          2常用的離心方法

          (1)差速離心法(又稱分步離心法)采用不同的離心速度和離心時間,使沉降速度不同的顆粒分步離心的方法,稱為差速離心。操作時,將含有兩種不同顆粒的混懸液,以常速離心,使大的顆粒下沉,將上清液傾倒于另一離心管中,再加大離心力,離心一定時間,分離小的顆粒,反復多次分離,達到分離目的。差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。差速離心法的優點是:操作簡單,離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開,并可使用容量較大的角式轉子;分離時間短、重復性高;樣品處理量大。缺點是:分辨率有限、分離效果差,沉淀系數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開,不能一次得到純顆粒;壁效應嚴重,特別是當顆粒很大或濃度很高時,在離心管一側會出現沉淀;顆粒被擠壓,離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。

          (2)密度梯度離心法(又稱區帶離心法)該法又分為速率區帶離心法和等密度區帶離心法。樣品在一定惰性梯度介質中進行離心沉淀或沉降平衡,在一定離心力下把顆粒分配到梯度液中某些特定位置上,形成不同區帶的分離方法。該法的優點是:具有很好的分辨率,分離效果好,可一次獲得較純顆粒;適用范圍廣,既能分離沉淀系數差的顆粒,又能分離有一定浮力密度的顆粒;顆粒不會積壓變形,能保持顆?;钚?,并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。缺點是:離心時間較長;需要制備梯度液;操作嚴格,不宜掌握。

          ①速率區帶離心法:是根據分離的粒子在離心力作用下,在梯度液中沉降速度的不同,離心后具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內形成幾條分開的樣品區帶,達到彼此分離的目的。臨床常使用的分離液是Ficoll、Percoll及蔗糖。把靜脈血中單個核細胞分離出來,前一種分離液將血液中單個核細胞(淋巴細胞和單核細胞)分為一個層,同時提出。而Percoll分離液將血中淋巴細胞和單核細胞分為二個梯度層,分別提取。后者分離效果優于前者,但操作繁瑣。

          ②等密度區帶離心法:當不同顆粒存在浮力密度差時,在離心力場下,顆?;蛳蛳鲁两?,或向上浮起,一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上(即等密度點)形成區帶,稱為等密度區帶離心法。等密度區帶離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒的大小和形狀無關,但后兩者決定著達到平衡的速率、時間和區帶的寬度。

          (3)分析性超速離心法

          ①分析型超速離心機的工作原理:分析型超速離心機主要由一個橢圓形的轉子、一套真空系統和一套光學系統所組成。該轉子通過一個柔性的軸連接成一個高速的驅動裝置,此軸可使轉子在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉,其容納兩個小室:分析室和配衡室。分析室的容量一般為1ml,呈扇形排列在轉子中,其工作原理與一個普通水平轉子相同。分析室有上下兩個平面的石英窗,離心機中裝有的光學系統可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質,可以通過對紫外光的吸收(如對蛋白質和DNA)或折射率的不同對沉降物進行監測。在分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個折射的透鏡,結果在檢測系統的照相底板上產出一個"峰",由于沉降不斷進行,界面向前推進,故"峰"也在移動,從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標。

          ②分析性超速離心法的應用范圍:測定生物大分子的相對分子重量。測定相對分子重量中應用最廣的是沉降速度法,用照相記錄,即可求出粒子的沉降系數。生物大分子的純度估計。分析型超速離心機已廣泛地應用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質的純度。分析生物大分子中的構象變化??梢酝ㄟ^檢查樣品在沉降速度上的差異來證實。

          3離心機的分類與結構

          (1)離心機的分類國際上對離心機的分類方法有三種,按用途分、按轉速分、按結構分。按用途可分為制備型、分析型和制備分析兩用型;按轉速分類可分為低速、高速、超速等離心機;按結構可分為臺式、多管微量式、細胞涂片式、血液洗滌式、高速冷凍式、大容量低速冷凍式、臺式低速自動平衡離心機等。

          (2)低速離心機它主要用作血漿、血清的分離及腦脊液、胸腹水、尿液等有形成份的分離;高速離心機:它主要用于臨床實驗室分子生物學中的DNA、RNA的分離和基礎實驗室對各種生物細胞、無機物溶液、懸浮液及膠體溶液的分離、濃縮、提純樣品等;超速離心機:超速離心機按用途分為制備型、分析型及分析制備兩用型三種。制備型超速離心機主要用于生物大分子、細胞器和病毒等的分離純化,能使亞細胞器分級分離,并可用于測定蛋白質及核酸的分子量;分析型超速離心機裝有光學系統,可拍照、測量、數字輸出、打印自動顯示系統等,可以通過光學系統對測試樣品的沉降過程及純度進行觀察。

          (3)專用離心機

          ①免疫血液離心機:用于臨床輸血、血型鑒定、交叉配血、淋巴細胞分離、血小板分離以及抗人球蛋白試驗等。

          ②微量毛細管離心機:用于血溶比試驗,微量血細胞比積以及放射性核素微量標記物的測定。

          ③尿沉渣分離離心機:用于尿液中有形成分的分離與尿液工作站相配套。

          ④細胞涂片離心機:用于腦脊液、胸腹水的脫落細胞的分離及涂片。

          (4)低速離心機、高速(冷凍)離心機及超速(冷凍)離心機的結構:①低速離心機的結構由電動機、離心轉盤(轉頭)、調速器、定時器、離心套管與底座等主要部件構成。②高速(冷凍)離心機的結構由轉動裝置、速度控制系統、溫度控制系統、真空系統、離心室、離心轉頭及安全保護裝置等。③超速(冷凍)離心機主要由驅動和速度控制、溫度控制、真空系統和轉頭四部分組成。

          (5)離心轉頭的分類應用及功能:離心機轉頭一般可分為五大類有①固定角轉頭②甩平式轉頭③連續流動轉頭④區帶轉頭⑤垂直轉頭。

          (6)離心機的主要技術參數及性能指標:主要參數包括:最大轉速;最大離心力;最大容量;電源功率;溫度控制范圍;工作電壓;調速范圍。離心機轉頭的常用標記及轉頭參數。離心機轉頭的常用標記是由三部分組成,第一部分為英文字母符號;第二部分為數字;第三部分為標識轉頭由不同的金屬組成。轉頭參數有,Rmax、Rmin、RCFmax、RCFmin、RPMmax、K等。

          4離心機的應用和維護

          (1)離心方法的選擇:選擇合適的離心轉速和離心時間,就能達到較好的分離效果。①若樣品中存在兩種以上質量和密度不同的樣品顆粒,可采用差速離心法。②對于有密度梯度差異的樣品介質,可采用密度梯度離心法。③若不同樣品顆粒的密度范圍在離心介質的密度梯度范圍內,離心時密度不同的物質顆粒因浮力差異或向下沉降,或向上漂浮,一直移到它們各自密度恰好對應的位置(等密度點),形成區帶??刹捎玫让芏忍荻入x心。

          (2)離心時間以及溫度和pH值的確定

          離心時間:依據離心方法的不同有所差別。①差速離心是指某種顆粒完全沉降到離心管底的時間。②等密度梯度離心是指顆粒完全到達等密度點的平衡時間。③密度梯度離心所需的離心時間則是指形成界限分明的區帶的時間。

          溫度和pH值:為了防止欲分離物質的凝集、變性和失活,除了在離心介質的選擇方面加以注意外,還必須控制好溫度及介質溶液的pH值等離心條件。離心溫度一般控制在40C左右,對于某些熱穩定性較好的酶等,也可以在室溫下進行。

          (3)離心機的使用、維護:各類離心機因其轉速高,產生的離心力大,使用不當或缺乏定期的檢修和保養,都可能發生嚴重事故,因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規程。

          (4)離心機常見故障及排除方法:①電機不轉②轉頭的損壞③機體震動劇烈、響聲異常。有許多故障為不正確操作所致,正確操作可減少或消除故障。在工作過程中,如出現任何異?,F象均應立即停機,檢查原因,不得強行運轉,以免產生不必要的損失。

          5離心方法和離心機的進展

          離心機的類型也越來越新穎,伊朗正在對將擁有更強力的轉子,旋轉速度更快,濃縮能力更強的P2離心機展開研究;俄羅斯立薩馬拉醫科大學的專家,已研制出了使下肢骨折患者更快地康復的新型醫用離心機并用于臨床治療;國內的一種結構簡單、操作方便、適應性強、安裝使用維修方便、分離時顆粒不易破壞的SS型三足式離心機已廣泛應用于各行業和科研實驗室。

          目前,離心方法已逐漸走向規范化、標準化、專業化。各種專用離心機,對所分離樣品由計算機自動控制程序設定了一定的轉速、相對離心力及離心時間等。

          文章來自:http://www.ytebara.com.cn/index.php?catid=877/



                        
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